Doser les phosphates inorganiques et organiques

Par Marco PAGNI

Dans le cadre de mon travail , il m'arrive fréquemment de doser les phosphates inorganiques et organiques dans des échantillons biologiques. J'utilise les deux protocoles donnés ci-dessous qui sont quantitatifs et fiables, mais qui, comme pour toute méthode analytique, requiert de travailler soigneusement. D'après quelques essais préliminaires, ils sont tout à fait applicables à des échantillons d'eau de mer.
 
ATTENTION Ces protocoles sont uniquement destinés à des personnes qui possèdent une formation de base en chimie analytique, et qui ont accès à un minimum d'équipement de laboratoire. Certains des réactifs utilisés sont dangereux à manipuler, comme l'acide sulfurique. Si vous n'avez aucune notion des règles de sécurités du laboratoire de chimie, renoncez-y, ou trouver un droguiste, un pharmacien, un chimiste, un biologiste, ou un géologue qui puisse vous aider. Il devrait être assez facile de dénicher un représentant d'une de ces professions au sein des associations aquariophiles locales.
 
N'oubliez pas que pour effectuer le dosage du phosphate dans un échantillon inconnu, il faut au moins effectuer la réaction sur un échantillon totalement dépourvu de phosphate, le "blanc", et sur un standard dont la concentration en phosphates est connue. De plus, si vous n'avez pas accès à un spectrophotomètre, ou à un colorimètre, pour lire l'absorbance, vous devrez réaliser une courbe de calibration, c'est-à-dire une série de dilutions précises du standard, qui vous fournira une échelle colorimétrique et qui vous permettra d'estimer "à l'oeil" votre concentration inconnue. Et pour être tout à fait sûre de vos résultats, faites deux
fois vos analyses, ou dupliquer chaque échantillon.
 
Dosage des phosphates inorganiques
 

N'oubliez pas!

- de porter des lunettes de protection
- de ne RIEN pipeter à la bouche

Solutions stocks

A: (NH4)6Mo7O24 4 H2O 2.5 % (stable)
B: H2SO4 6 N (stable, provoque de graves brûlures)
C: acide ascorbique (vitamine C) 10 % (se conserve quelques semaines au frigo)
Réactif I
A : B : C : H2O (1:1:1:2) à préparer juste avant l'emploi

Protocole

dans un tube propre, ou dans une cuvette de spectrophotomètre, mettre 500 µl d'échantillon à analyser (ou du blanc, ou du standard)
ajouter 500 µl de réactif I
mélanger
incuber 2 à 4 h à température ambiante (ou 30 min à 45°C)
mesurer l'absorbance à 820 nm (ou comparer l'intensité de la coloration bleue à celles de votre échelle de standards)

Calcul

La concentration dans l'échantillon est estimée sur l'échelle de calibration, ou si on dispose d'un spectrophotomètre et que son zéro ait été fait sur le blanc par
[échantillon]=[standard]*OD820(échantillon)/OD820(standard)
Référence
Chen PS, Toriba TY & Warner H (1956) Microdetermination of phosphorus. Analytical chemistry 28: 1756-1758

Protocole pour phosphates totaux

 
Les phosphates organiques s'obtiennent en soustrayant les phosphates inorganiques des phosphates totaux.
Il vous faudra disposer de tubes à essai à usage unique supportant d'être chauffé à la flamme (j'utilise des tubes en "borosilicate") et des billes de verre pour les obturer (dans tous les bons magasins de jouets)

N'oubliez pas!

de porter des lunettes de protection
de ne RIEN pipeter à la bouche
de minéraliser vos échantillon sous une chapelle ad hoc à cause des fumées nocives

Solutions stocks

A: (NH4)6Mo7O24 4 H2O 2.5 % (stable)
B: H2SO4 6 N (stable, provoque de graves brûlures)
C: acide ascorbique (vitamine C) 10% (stable quelques semaines au frigo)
D: Mg(NO3)2 10 % dans l'ethanol (stable)
E: HCl 1 N (stable, provoque de graves brûlures)
Réactif II
A : B : C : H2O (15:15:7:63) à préparer juste avant l'emploi
Protocole
l'échantillon à analyser est placé dans un tube en "borosilicate" (pour simplifier les calculs, des volumes identiques d'échantillon, de blanc et de standard sont placés chacun dans chaque tube)
ajouter 50 µl de nitrate de magnésium alcoolique (D)
sécher complètement (une nuit dans une étuve à 95°C, par exemple)
minéraliser l'échantillon en chauffant la base du tube avec la flamme d'un bec bunsen. Travailler sous une chapelle pour ne pas respirer les oxydes d'azotes qui se dégagent (fumée rougeâtre et toxique). Protégez-vous les yeux, un tube peut toujours éclater. Chauffer le plus possible, mais ne faîtes quand même pas fondre le tube. Laisser refroidir
ajouter 300 µl d'acide chlorhydrique (E)
fermer le tube avec une bille de verre propre
incuber 15 min au bain marie à 100°C. Laisser refroidir
ajouter 700 µl de réactifs II
mélanger
incuber 2 à 4 h à température ambiante (ou 30 min à 45°C)
lire l'absorbance à 820 nm

Calcul

La concentration dans l'échantillon [échantillon] est estimée sur l'échelle de calibration, ou si on dispose d'un spectrophotomètre et que son zéro ait été fait sur le blanc au moyen de
[échantillon]=[standard]*OD820(échantillon)/OD820(standard)

Référence

adapté d'après Ames BN (1966) Assay of inorganic phosphate, total phosphate and phosphatases. in Methods in Enzymology Vol. VIII, pp. 115-118

Résultats escomptés

Les réactifs I ou II fraîchement préparés possèdent une couleur qui varie entre le jaune et le vert très pâle. Une coloration bleutée du réactif est le signe d'une contamination. Lorsque le blanc est dépourvu de phosphate, il possède une absorbance d'environ 0.03 OD820 (après incubation) lorsque le zéro du spectrophotomètre est fait sur de l'eau.
Un standard de phosphate 50 µM procure une absorbance d'environ 0.55 OD820. Cette réponse est susceptible de fluctuer en fonction des réactifs et du spectrophotomètre utilisés.
La réaction produit une absorbance directement proportionnelle à la concentration en phosphate entre 0 et 1.1 OD820 (zéro du spectrophotomètre fait sur le blanc), soit entre 0 et 100 µM de phosphate environ.
La limite inférieur de détection de la méthode est de 1 à 2 µM. La méthode permet donc de quantifier les phosphates jusqu'à une limite inférieur de 5 µM environ, ce qui correspond à 0.395 mg de PO43- par litre.
Comme standard, j'utilise une solution de phosphate 50 µM obtenue en diluant 8.709 mg de K2HPO4 dans 1 litre. Cette solution contient donc 3.95 mg de PO43- par litre. N'importe quel autre sel de phosphate (soluble) peut convenir comme standard.

Contaminations

Utiliser une eau de très bonne qualité (par exemple de l'eau bidistillée) pour préparer toutes vos solutions.

Les phosphates sont utilisés comme additifs dans la plupart des produits de vaisselles et contaminent souvent la verrerie de laboratoire. Deux techniques permettent de les éviter presque à coup sure
Faire bouillir deux fois toute la verrerie (y compris les bouchons) dans de l'eau distillées, après le lavage normal.
 

Utiliser systématiquement de la "vaisselle" en plastique à usage unique. Par exemple des tubes eppendorfs pour les réactions et des embouts en plastique de pipettes automatiques pour les dilutions et les ajouts de réactif.

Remarques

La mesure des phosphates inorganiques peut être faussée par la présence de phosphates organiques instables en solution acide. Le glucose 1-phosphate en est un exemple. La présence de ce genre de composé est très peu probable dans de l'eau d'aquarium.

 
Si l'idée vous venais de modifier les proportions des mélanges réactionnels ci-dessus, prenez bien garde de ne pas changer la concentration finale en acide, qui est critique pour le développement de la coloration. Il devrait dès lors être facile de mettre au point une méthode pour doser le phosphate contenu dans le sable de corail, par exemple.
 
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